Strukturbiologische und mechanistische Untersuchungen zur Erkennung und Reparatur von DNA-Photoschäden

Es ist bekannt, dass der UV-Anteil des Sonnenlichts zur Schädigung der DNA und zur

Ausbildung einer Vielfalt an DNA-Photoschäden führt. Die dabei entstehenden cytotoxischen

und mutagenen Schäden sind Cyclobutanpyrimidindimere (CPD-Schäden), (6-4)-

Photoschäden, als auch dessen Dewar Valenz-Isomere. Heutzutage besteht kein Zweifel

daran, dass diese Schäden eng mit dem Auftreten von Hautkrebs in Verbindung stehen. Um

sich vor den negativen Auswirkungen der Photoschäden schützen zu können, haben sich alle

dem Sonnenlicht ausgesetzte Lebewesen im Laufe der Evolution ein multifunktionelles und

effizientes Reparatursystem angeeignet. Hier wären zum Beispiel die Exzisionsreparatur von

geschädigter DNA und die direkte Reversion der Schäden zu nennen. Die letztgenannte Form

der Reparatur nennt man Photoreaktivierung und wird der Enzymklasse der Photolyasen

zugeschrieben. Diese Photolyasen sind paradoxerweise in der Lage, mit Hilfe von UV-A/Bbzw.

Blaulicht (300 - 500 nm), Pyrimidindimere wieder in ihre intakten Basen umzuwandeln.

Die Photolyasen sind hochselektive Enzyme und lassen sich je nach Substratspezifität in

CPD- und (6-4)-Photolyasen unterteilen.

In den letzten Jahren hat sich der CPD-Schaden zusammen mit der CPD-Photolyase als

Modellsystem bei der Untersuchung zur Entstehung und Reparatur von DNA-Photoschäden

entwickelt. So sind zum Beispiel der Reparaturmechanismus sowie die Cofaktoren-

Zusammensetzung der CPD-Photolyasen weitestgehend geklärt. Im Gegensatz dazu weiß man

vergleichsweise wenig über die (6-4)-Schäden und ihre Photolyasen. Aufgrund der

Ähnlichkeit zu den CPD-Photolyasen, wurde für die (6-4)-Photolyasen ein ähnlicher

Reparaturmechanismus postuliert, wobei jedoch der dabei auftretende viergliedrige

Übergangszustand (ein Oxetan- oder Azetidin-Intermediat) experimentell nicht nachgewiesen

werden konnte.

Um speziell diese als auch weitere Fragen bezüglich der (6-4)-Schadenserkennung und

Reparatur durch die (6-4)-Photolyasen klären zu können, musste der (6-4)-Schaden in

ausreichenden Mengen für biochemische und strukturbiologische Experimente synthetisiert

werden.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte schließlich eine Methode optimiert werden, mit der man

durch direkte Belichtung von Oligonukleotiden bei 254 nm unter Auschluss von Sauerstoff,

ausreichende Mengen an (6-4)-Schaden enthaltener DNA isolieren konnte.

Die Kristallstruktur des T(6-4)T-Schadens im Komplex mit der (6-4)-Photolyase aus D.

melanogaster konnte mit einer Auflösung von 2.0 Å erhalten werden und zeigte eine für

Photolyasen typische Architektur mit einer N-terminalen /-Domäne, einer C-terminalen -

helikalen Domäne sowie einem Interdomänen-Loop. Die DNA wird bei der Bindung durch

die (6-4)-Photolyase vollständig geöffnet und der Schaden um nahezu 180 ° in die aktive

Tasche des Enzyms gedreht. Nach Reduktion mit Natriumdithionit und Belichtung mit

Weißlicht konnte die Reparatur auch im Kristall durchgeführt und die entsprechende Struktur

(2.7 Å) mit den intakten Basen im aktiven Zentrum erhalten werden (Abbildung 2b). Eine

weitere Struktur (2.9 Å) mit dem T(6-4)C-Schaden im Komplex mit der Photolyase zeigte

eine ähnliche Struktur verglichen mit dem T(6-4)T-Schaden auf.

Anhand der erhaltenen Strukturdaten und weiteren Mutationsstudien konnte nach

Aktivitätsbestimmungen der einzelnen Mutanten die katalytisch essentielle Triade His365-

His369-Tyr423 charakterisiert werden (siehe Abbildung 2), wobei ebenfalls zwei Co-

Kristallstrukturen der Mutanten H365N (3.2 Å) und H369M (3.2 Å) erhalten werden konnten.

In keiner der Co-Kristallstrukturen konnten Hinweise auf den angenommenen viergliedrigen

Übergangszustand gefunden werden, so dass unter Einbeziehung der Mutationsstudien ein

neuer Reparaturmechanismus postuliert wurde. Als zentrales Intermediat wird hierbei ein

Radikal am C5 des Pyrimidinrings postuliert, wobei diese These durch Reparaturexperimente

mit einem U(6-4)T-Schaden weiter gestützt werden konnte.

Durch die Verwendung des modifizierten T(6-4)C*-Schadens und der folgenden

Umwandlung in den T(Dew)C*-Schaden, konnte zudem erstmals experimentell nachgewiesen

werden, dass die Reparatur der Dewar Valenz-Isomere über die entsprechenden (6-4)-

Schäden als Intermediat verläuft. Durch Reparaturexperimente mit der H365N Mutante und

der oxidierten Form der (6-4)-Photolyase konnte diese Isomerisierung als ein

Elektronentransfer katalysierter Prozess identifiziert werden. Die in diesem Zusammenhang

erhaltenen Co-Kristallstrukturen des T(6-4)C*- (2.0 Å) und des T(Dew)C*-Schadens (2.3 Å)

zeigten dabei keine großen Änderungen zu dem unmodifizierten T(6-4)C-Schaden auf.

Nach den strukturbiologischen und mechanistischen Untersuchungen konnte schließlich noch

die Frage des zweiten Cofaktors der (6-4)-Photolyase aus D. melanogaster geklärt werden.

Rekonstitutionsversuche mit den vier in Frage kommenden Cofaktoren FAD, FMN, MTHF

und F0 haben dabei in UV- und Fluoreszenzmessungen gezeigt, dass nur das F0 von dem

Enzym gebunden wurde. Aktivitätsstudien mit dem mit F0 rekonstituierten Enzym haben

dabei einen Anstieg der Reparatur um den Faktor 5 ergeben, wobei ebenfalls eine

Kristallstruktur mit dem gebunden Cofaktor erhalten werden konnte (2.1 Å). Der Cofaktor

konnte zusätzlich durch Extraktion direkt aus Fruchtfliegen in D. melanogaster nachgewiesen

werden.